Brassinosteroidy

Kategorie: Nezařazeno (celkem: 23160 referátů a seminárek)

Informace o referátu:

Příbuzná témata



Brassinosteroidy

Brassinolid je zřejmě nejdůležitějším zástupcem Brassinosteroidů
Brassinolid je zřejmě nejdůležitějším zástupcem Brassinosteroidů

Brassinosteroidy jsou skupinou látek, náležejících mezi Rostlinné hormony.

Obsah

Objev brassinosteroidů

Samotnému objevu v rostlinách předcházelo zjištění, že pylové extrakty stimulují růst rostlin. Mitchel et al., sebrali v roce 1970 [zdroj?] pyl z asi 60ti druhů rostlin a přibližně polovina těchto pylových extraktů podporovala růst fazolových semen. Látka v pylu zlepšující růst byla nazvána brassin. Později se ukázalo, že aktivní látky je v brassinu pouze nepatrné množství. Tato aktivní složka byla izolována vědci z Northern Regional Research Center – Peoria v roce 1979 v množství 4 mg ze 40 kg pylu řepky olejky (Brassica napus) a byla pojmenována brassinolid, podle zdroje pylu. Současně byla krystalografickou analýzou stanovena její struktura (Yokota, 1999).

V roce 1982 byl izolován jako druhý ze skupiny brassinosteroidů castasteron z hmyzích hálek kaštanovníku (Castanea crenata). Následoval objev dolicholidu a mnoha dalších.

Do roku 2000 bylo objeveno 56 přirozených brassinosteroidů a stále ještě přibývají (Bajguz a Tretyn, 2003). Navíc se v dnešní době chemicky připravuje mnoho strukturních analogů brassinolidu. Od doby objevení brassinosteroidů se mnoho vědců zabývá jejich výzkumem, studují jejich chemickou strukturu, syntézu a biologickou aktivitu, molekulární mechanizmy účinku, vliv na rostliny, výskyt v rostlinách, transport a metabolizmus v rostlinách a v neposlední řadě také praktické využití brassinosteroidů v zemědělství (přičemž v některých zemích už byly brassinosteroidy schváleny k polnímu použití, v Číně byl 28-homobrassinolid registrován jako růstový regulátor pro tabák, cukrovou třtinu, čajovník, ovocné stromy a řepku, v Rusku byl 24-epibrassinolid registrován jako růstový regulátor brambor, rajčat, okurek, pepře a ječmene a i v dalších zemích jsou brassinosteroidy využívány v zemědělství) (Khripach et al., 1997).

Přirozený výskyt brassinosteroidů

Brassinosteroidy byly nalezeny ve všech druzích rostlin, u kterých byl proveden podrobnější výzkum (jednoděložných i dvouděložných), a jsou obsaženy ve všech rostlinných orgánech. Výskyt brassinosteroidů v kořenech byl potvrzen teprve nedávno (0,3 ng/g čerstvé váhy castasteronu) (Kim et al., 2000a).

Brassinosteroidy jsou v rostlinách přítomny v extrémně nízkých koncentracích. Vnitrobuněčný obsah brassinosteroidů kolísá v závislosti na typu orgánu, stáří tkáně a druhu rostliny. Mladé tkáně jich obsahují větší množství než zralé tkáně, pyl a semena jsou nejbohatšími zdroji (obsahují nejčastěji 1-100 ng /g čerstvé váhy, zatímco listy a výhonky mají obvykle nižší množství, a to 0,01-0,1 ng /g čerstvé váhy). Dosud nejvyšší koncentrace byla zaznamenaná v pylu cypřiše (Cupressus arizonica), a to 6,4 ?g 6-deoxotyphasterolu /g čerstvé váhy. Dalším zajímavým místem výskytu jsou hmyzí hálky kaštanovníku nebo hálky v květech u Distylium racemosum a barvínku (Catharanthus roseus). Tyto hálky obsahují také vyšší koncentrace brassinosteroidů (Bajguz a Tretyn, 2003).

Přítomnost brassinosteroidů v nižších rostlinách byla dokázána u zelené řasy (Hydrodictyon reticulatum), játrovky (Marchantia polymorfa) a přesličky (Equisetum arvense). Někdy je množství brassinosteroidů tak malé, že ho nelze určit, postačí tedy když jsou nalezeny enzymy biosyntetické dráhy, která je v nižších rostlinách pravděpodobně stejná jako ve vyšších rostlinách. Mezi brassinosteroidy je u rostlin nejvíce rozšířen castasteron, následován brassinolidem a typhasterolem. Přítomnost různých brassinosteroidů v kukuřici (Zea mays L.) byla zkoumána u obilek typu koňského zubu a u cukrové kukuřice. Koňský zub obsahoval 120 ng/g čerstvé váhy castasteronu, 6,6 ng/g čerstvé váhy typhasterolu a 4,1 ng/g čerstvé váhy teasteronu. Obilky cukrové kukuřice obsahovaly 27,2 ng/g čerstvé váhy castasteronu, 18,3 ng/g čerstvé váhy 28-norcastasteronu a 16,9 ng/g čerstvé váhy dolichosteronu (Bajguz a Tretyn, 2003, Kim et al., 2002).

Testovací systémy (biotesty)

Počáteční studie brassinosteroidů byly zaměřeny na jejich schopnost stimulovat růst. Byly vyvinuty dva testovací specifické systémy a citlivé k brassinosteroidům. Jsou to test druhého fazolového internodia (second bean internode test) a test odchylky jazýčku rýže (rice lamina inclination test).

Test druhého fazolového internodia byl vyvinut při první izolaci brassinolidu z pylu řepky. Yopp et al., (1979) zjistili, že účinky brassinolidu jsou odlišné od účinků jiných hormonů při testech využívajících hákovité stáčení a prodlužovací růst hypokotylů fazolu v testu druhého fazolového internodia. Uřízlá druhá internodia ze sazenic fazolu (Phaseolus vulgaris), které byly ošetřeny brassinolidem v lanolinové pastě, se prodlužovala, zakřivovala, bobtnala nebo se rozdělovala. Síla těchto jevů závisela na množství brassinolidu. Při nižších koncentracích brassinolid vyvolal prodlužovací růst, zakřivování a bobtnání internodií a při vyšších koncentracích vyvolával rozdělování internodií (Yokota, 1999). Při tomto testu jsou pouze brassinosteroidy schopné vyvolat rozdělení internodia, ostatní rostlinné hormony ho nevyvolají. Další zkoušky citlivosti k brassinosteroidům také využívají růstu internodií (Kohout et al., 1991).

Test odchylky jazýčku rýže byl původně vyvinut při testování auxinu. Je při něm zjišťováno odklonění čepele listu rýže. Ta se odklání proto, že buňky na adaxiální straně jazýčku se selektivně prodlužují jako odpověď na auxin, zatímco ty na abaxiální straně jsou k němu méně citlivé. Použitím této metody testování byl zkoumán rozdíl biologické aktivity brassinolidu a auxinu. Úhel odchýlení vyvolaný 5,7x10-5 M auxinem byl shodný s úhlem vyvolaným 2x10-9 M brassinolidem, což dokazuje, že brassinolid je v tomto testu aktivní v koncentracích 1000krát menších než auxin (Fuji and Saka, 2001).

Další vysoce citlivé testy jsou založeny např. na na inhibici růstu etiolovaných sazenic hrachu (Pisum sativum) (Kohout et al., 1991).

Brassinosteoidy a ostatní fytohormony

Dříve byly brassinosteroidy považovány pouze za růstové regulátory spolu s polyaminy, kyselinou jasmonovou, oligosacharidy nebo některými fenolickými látkami, ale díky objevení brassinosteroidových mutantů huseníčku (Arabidopsis thaliana) a hrachu (Pisum sativum) v roce 1996 a 1997 byly na konferenci v Japonsku v roce 1998 zařazeny mezi fytohormony, vedle již uznávaných pěti skupin hormonů (auxiny, gibbereliny, cytokininy, kyselina abscisová a etylen).

Mechanizmus jejich působení se od účinku ostatních fytohormonů liší a není na nich závislý (Rao et al., 2002). Interakce mezi hormony je však základem pro koordinaci rostlinného vývoje.

Mnoho vývojových procesů, které jsou ovlivněny brassinosteroidy, je zároveň řízeno i dalším hormonem - auxinem (prodlužování stonku a kořenů, klíčení semen, apikální dominance aj.). Brassinosteroidové a auxinové signální dráhy se sbíhají na úrovni transkripčních regulací cílových genů.

Oba hormony mají ale jinou kinetiku působení. U soji (Glycine max) např. brassinolid stimuloval prodlužování epikotylu 45 min po aplikaci a tato stimulace dosáhla vrcholu po několika hodinách. Odpověď rostliny na auxin byla naopak relativně rychlá, začala po 10-15 min a gradovala po 30-45min. Podobná kinetika byla také nalezena na úrovni genové regulace u huseníčku. Mutant axr1-3 (necitlivý k auxinu) byl necitlivý také k působení brassinollidu při prodlužování výhonku. Naopak brassinosteroidoví insenzitivní bri1 a deficitní sax1 mutanti vykazovali zvýšenou inhibici růstu kořenů při reakci na auxin. To naznačuje, že způsob účinku obou hormonů může být odlišný v různých tkáních a možná i mezi rostlinnými druhy. Jiné studie dokázaly, že některé geny, které jsou regulovány auxiny, jsou cílem také pro působení brassinosteroidů. Mnoho genů je regulováno oběma hormony, např. geny rodin AUX/IAA, SAUR a GH3. Spolupůsobení obou hormonů potvrzuje také to, že brassinosteroidy regulují PIN geny, které jsou esenciální pro polární transport auxinu a auxin reguluje expresi genů BRI, BRL2 a BRL3, které se účastní signální dráhy brassinosteroidů (Halliday, 2004).

Brassinosteroidy jsou závislé na změnách poměru auxinu/cytokininu v rostlinných tkáních. Vzrůst obsahu auxinu v rostlinných buňkách po exogenní aplikaci brassinosteroidů a biosyntetické expresi genů byl následován významným poklesem koncentrace cytokininu nebo zvýšením degradace cytokininu v transformovaných rostlinách tabáku (Ono et al., 2000). Většina prací popisuje stimulaci syntézy etylenu po aplikaci brassinosteroidů, např. u etiolovaných rostlin vigny (Vigna radiata). Bylo popsáno i snížení hladiny kyseliny abscisové po aplikaci 24-epibrassinolidu v etiolovaných hypokotylech tykve (http://chemicke-listy.vscht.cz). Vliv aplikace exogenních brassinosteroidů na endogenní hladiny kyseliny abscisové je velmi různorodý, na jedné straně po aplikaci 24-epibrassinolidu dochází ke zvýšení hladiny kyseliny abscisové v rostlinách bavlníku (Gossypium hirsutum) a v hypokotylech okurky (Cucumis sativus), na druhé straně bylo popsáno snížení hladiny kyseliny abscisové po aplikaci 24-epibrassinolidu v etiolovaných hypokotylech tykve (Cucurbita pepo). (Ono et al., 2000). Dormance semen a jejich klíčení jsou regulovány kyselinou abscisovou a gibbereliny. Tyto dva hormony spolu účinkují antagonisticky. Kyselina abscisová indukuje dormanci semen a inhibuje jejich klíčení. Gibberelliny tuto dormanci přerušují. V práci Stebera a Mc Courta (2001) je dokázáno, že 24-epibrassinolid obnoví klíčení mnoha gibberelinových biosyntetických mutantů (např. ga1-3, ga2-1 aj.) a gibberelinového insenzitivního mutanta sly1. Autoři také zjistili, že klíčení brassinosteroidového deficitního mutanta huseníčku det2-1 a brassinosteroidového insenzitivního mutanta bri1-1 je silněji inhibováno kyselinou abscisovou, než klíčení divokého typu. Brassinosteroidy stimulují klíčení a jejich signál je nejspíš potřebný při překonávání inhibice, která je vyvolaná kyselinou abscisovou. Částečná kompenzace klíčení v gibberelinových mutantech pomocí 24-epibrassinolidu může být ale způsobena stimulací růstu hypokotylu, a tím i růstu embrya v klíčícím semeni. Stále tedy není zodpovězena otázka, zda mají brassinosteroidy esenciální roli při klíčení semen. Pokud ano, tak můžeme očekávat, že bude získán neklíčící fenotyp i mezi brassinosteroidovými mutanty (Steber a Mc Court, 2001). Společná aplikace gibberelinu a brassinolidu na rostliny begónie (Tabebuia alba) snížila koncentraci kyseliny abscisové v postranních pupenech, což vedlo k jejich vývoji. Ošetření begónie gibberelinem a následně brassinolidem působilo výrazně pozitivně na růst stonku sazenic, ale ošetření samotným brassinolidem velký vliv nemělo. Aplikace brassinolidu samotného nebo v kombinaci s gibberelinem způsobila nárůst tloušťky listové čepele. Gibberelin a brassinosteroidy působí na stejné růstové a vývojové procesy, a to zřejmě aditivně (Ono et al., 2000). Brassinosteroidy a gibbereliny působily aditivně také na růst epikotylů fazolu. Jejich růstově regulační vliv byl pozorován také na odříznutých segmentech hypokotylu okurky, obě látky aditivně podpořily růst (Müssig, 2005) Aplikace 24-epibrassinolidu obnovila citlivost huseníčkových hypokotylových buněk ke gibberelinu. Nedávné zprávy o deficitních mutantech dwf4 a sax1 podaly důkaz, že plně aktivní brassinosteroidová biosyntetická dráha je potřebná pro plnohodnotnou gibberelinovou odpověď (Werbrouck et al., 2003).

Syntéza a degradace brassinosteroidů v rostlinách

Biosyntetická dráha brassinolidu byla poprvé objasněna za použití kultury buněk barvínku (Catharanthus roseus), u kterého byl dokázán přirozený výskyt intermediátů biosyntetické dráhy a většina kroků byla také určena za pomoci značenných substrátů a identifikací metabolitů. Biosyntetická dráha syntézy brassinolidu může být rozdělena na syntézu základních sterolů (cycloartenol a campesterol), a specifickou dráhu od campesterolu k brassinolidu. Rostlinné steroly jako např. campesterol jsou integrální složkou membrán, slouží jako regulátory tekutosti a propustnosti membrán a přímo ovlivňují aktivitu membránových proteinů včetně enzymů a složek signálních drah. Mutace v genech kódujících enzymy biosyntetické dráhy sterolů mohou také výrazně ovlivnit vývoj rostliny (Clouse, 2002).

Mutanti

Mutanty můžeme rozdělit na mutanty s nedostatkem brassinosteroidů, u kterých je ovlivněn nějaký gen účastnící se biosyntézy brassinosteroidů (deficitní, např. det2, cpd, dwf1, bas1, sax1 atd.), a mutanty necitlivé k působení brassinosteroidů, u kterých je ovlivněna signální dráha (insenzitivní, např. bri1, bin2, bes1, bzr1 a bak1). Většina jich byla objevena u huseníčku, hrachu a rajčete (Nomura et al., 1997, 1999, Bishop et al., 1999, Clouse and Feldmann, 1999, Koka et al., 2000). Det2 (deetiolated), který byl prvním objeveným deficientním mutantem, byl získán jako defektní v regulaci růstu na světle a ve tmě. Rostliny rostoucí ve tmě měly fenotyp rostlin rostoucích na světle a exprimovaly geny regulovatelné světlem. Následně byla zvýšená exprese světlem regulovatelných genů potvrzená v sazenicích cpd (constitutive photomophogenesis and dwarfism) mutanta rostoucího ve tmě. Det2 a dwf4 (dwarf4) mutanti mají defekt v diferenciaci chloroplastů z etioplastů. (Nagata et al., 2000). Bri1 (brassinosteroid-insensitive) patří mezi mutanty s nejvíce defekty (Clouse et al., 1996). Brassinosteroidové deficitní a insenzitivní mutanti mají mnoho vývojových defektů, mají sníženou klíčivost semen, jsou zakrslí, mají tmavě zelené zakřivené listy, sníženou fertilitu, zpožděný reproduktivní vývoj a ve tmě rostou jako by rostly na světle (de-etiolovaní) (Wang a He, 2004, Bishop a Koncz, 2002). Tyto defekty mohou být kompenzovány přidáním brassinolidu pouze u deficitních mutantů (Asami a Yoshida, 1999).

Biosyntéza základních sterolů

Základní steroly pro biosyntézu brassinosteroidů jsou syntetizovány in vivo z cykloartenolu a ten vzniká ze squalenu. Cykloartenol je první cyklický prekurzor, který se pak mění na campesterol. Mutanti huseníčku, jejichž biosyntetická dráha je přerušena v časné fázi syntézy sterolů, mají některé charakteristiky brassinosteroid-deficitních mutantů v dospělosti, ale mají i specifické defekty v embryogenezi, které nebyly zjištěny u brassinosteroidových mutantů ani u mutantů v pozdějších krocích biosyntézy sterolů. Bylo zjištěno, že mutant fackel je alelický k mutantovi extralong-lifespan, a FACKEL gen kóduje reduktasu katalyzující přeměnu 4?-metyl-5?-ergosta-8,14,24(28)-trien-3?-ol na 4?-metylfecosterol. U fackel mutantů jsou výrazně snížené obsahy různých brassinosteroidů, campesterolu a sitosterolu, zatímco substrát sterol C-14 reduktasy se v nich akumuluje desetinásobně (Jang et al., 2000). Smt mutant huseníčku má mnoho fenotypových vlastností fackel mutanta, je u něj přerušen krok vedoucí od cykloartenolu k 24-metylen cykloartenolu. Gen SMT kóduje enzym schopný C-24 alkylace postranního sterolového řetězce v přítomnosti S-adenosylmethioninu. V smt mutantech se akumuluje cholesterol na účet sitosterolu, přestože koncentrace ostatních sterolů jsou relativně normální. Mutanti fackel a smt mají narušenou embryogenezi, embrya zůstávají v globulárním, neorganizovaném stádiu, vyvíjející se sazenice mají často více než dvě dělohy, hypokotyl je jen málo vyvinut. Koncentrace mRNA potvrdily vysokou expresi FACKEL a SMT genů během vývoje embrya divokého typu (Diener et al., 2000). Přestože fackel mutanti mají mnoho rysů brassinosteroid-deficitních mutantů, tak nejsou kompenzováni (změněny fenotypově na divoký typ) ošetřením brassinosteroidy, ale zachovávají si citlivost k brassinosteroidům (Jang et al., 2000). Další krok biosyntézy, pro který jsou dostupní mutanti, zahrnuje zavedení C-5 dvojné vazby do B-kruhu episterolu. Mutant ste1 akumuluje ?7 steroly na úkor příslušných ?5 sterolů. Gen STE kóduje ?7-C-5-desaturasu. Mutanti dwf7 jsou aleličtí k ste1 (Clouse, 2002). Huseníčkový DWF7 gen katalyzuje přeměnu episterolu na 5-dehydroepisterol (Asami a Yoshida, 1999). Ste1/dwf7 mutanti mají rysy deficitních mutantů (i když ne tak výrazně) a mohou být kompenzováni ošetřením brassinosteroidy (Choe et al., 1999). Pro další krok biosyntetické dráhy, přeměnu 5-dehydroepisterolu na 24-metylencholesterol pomocí ?7 sterol reduktasy, byl nalezen mutant huseníčku dwf5, zjištěný stejnými metodami a také kompenzovatelný exogenní aplikací brassinosteroidů (Choe et al., 2000). Na konci biosyntetické dráhy sterolů je izomerizace a redukce 24-metylencholesterolu na campesterol. S touto reakcí je spojováno více mutantů, dwf1, dim a cbb1, kteří jsou aleličtí pro tuto reakci. Jsou kompenzováni aplikací brasisnosteroidů. DWF1 gen kóduje oxidoreduktasu (Clouse 2002). DWF protein je Ca2+/kalmodulin vazebný protein a tato vazba je nezbytná pro jeho funkci. Stačí částečná ztráta této funkce, aby způsobila zakrslý fenotyp (Du a Poovaiah, 2005).

Biosyntéza brassinolidu z campesterolu

V rostlinách byly zatím objeveny 3 dráhy biosyntézy brassinolidu. Je to biosyntetická dráha C27 brassinosteroidů a dráha syntézy C28 brassinosteroidů, která se dělí na časnou a pozdní C6 oxidační dráhu. Tyto dráhy mohou u některých rostlinných druhů fungovat všechny společně (např. u huseníčku, kde společný výskyt 6-deoxo a 6-oxo forem brassinolidových prekurzorů naznačil spolupůsobení obou drah), jinde je některá z nich převládající. Například cathasteron nebyl detekován v rajčeti a rýži, a proto se zdá, že u těchto rostlin je dominantní pozdní C6 oxidační dráha, zatímco v rajčeti byla zatím dokázána jen pozdní C-6 oxidační dráha (Kim et al., 2004, 2005). Navíc se předpokládá, že pozdní C6 oxidační dráha je hlavním zdrojem brassinolidu v sazenicích huseníčku rostoucích na světle, zatímco časná C6 oxidace může být dominantní ve tmě (Noguchi et al., 2000). Přeměna membránového sterolu campesterolu na brassinolid se děje přes sérii redukcí, hydroxylací, epimerizací a oxidací, které byly důkladně studovány u mnoha rostlinných druhů (Obr.1). První 4 reakce vedou k syntéze campestanolu přes redukci dvojné vazby v campesterolu. Mutant huseníčku det2 je mutantem pro tuto reakci. Gen DET2 má sekvenční identitu k savčím 5?-steroid reduktasám (Li et al., 1996). Aplikace brassinosteroidů může kompenzovat det2 mutanty a vnitrobuněčná koncentrace campestanolu je u nich snížena v porovnání s divokým typem (Fujioka et al., 1997). Det2 má i typický fenotyp brassinosteroidového mutanta, který ovšem oproti cpd a bri1 nemá tak výrazné defekty, což je zřejmě způsobeno zbytkovým campestanolem přítomným v det2. Ten může být vytvářen druhou reduktasou katalyzující stejnou reakci, podobně jako v případě DWF7 i DET2 katalyzuje krok přeměny (24R)-24-metylcholest-4-en-3-onu na (24R)-24-metyl-5?-cholestan-3-on (Noguchi et al., 1999). Mutant sax1 může také ovlivnit přeměnu campesterolu na campestanol. Sax1 má fenotyp brassinosteroidových deficitních mutantů a může být částečně kompenzován ošetřením brassinosteroidy. Nemá ale typický de-etiolovaný fenotyp ve tmě. Sax1 má blokovanou syntézu brassinolidu v kroku předcházejícím det2 a hraje roli v nějaké postranní syntetické dráze přeměny campesterolu na 6-deoxocathasteron přes 22-hydroxylované intermediáty (Ephritikhine et al., 1999). Role sax1 v biosyntéze není tedy jasná tak, jako u ostatních brassinosteroid-deficitních mutantů, kteří byli plně charakterizováni. Od campestanolu se dráha dělí na časnou a pozdní C-6 oxidační větev.


Reakce přeměny campestanolu na 6-deoxocathasteron (pozdní C-6 oxidační dráha) a 6-oxocampestanolu na cathasteron (časná C-6 oxidační dráha) jsou obě katalyzované produktem DWF4 genu, který kóduje cytochrom P450 se sekvenční homologií k savčím steroid hydroxylasám (Choe et al., 1998). Dwf4 mutant může být kompenzován pouze 22?-hydroxylovanými meziprodukty biosyntézy brassinolidů a syntetickými sloučeninami, jako je 22-hydroxycampesterol. Toto dokazuje, že DWF4 funguje jako C-22 steroid hydroxylasa (Clouse, 2002). Nadměrná exprese DWF4 genu způsobí nárůst délky hypokotylu (Müssig, 2005). Další krok obou větví dráhy také zahrnuje postranní hydroxylaci a je katalyzován produktem CPD genu (alelický k CBB3 a DWF3), který kóduje cytochrom P450, který je podobný DWF4. Cpd mutant je extrémě zakrslý a může být kompenzován pouze 23?-hydroxylovanými brassinosteroidy, což dokazuje, že CPD účinkuje jako C-23 steroid hydroxylasa (Szekeres et al., 1996). Tedy C-22 a C-23 pozice brassinosteroidů jsou úspěšně hydroxylovány cytochromy P450, kódovanými geny DWF4 a CPD. Jejich funkce a i jejich DNA sekvence jsou podobné (Asami et al., 2000).

Mutanti, kteří mají blokované kroky biosyntézy za enzymem CPD a mutanti v biosyntéze C27 brassinosteroidů nebyli zatím důkladněji identifikováni (Clouse a Feldmann, 1999). Biosyntéza brassinolidu u huseníšku je pravděpodobně spíš síť než nezávislé lineární dráhy. Je zajímavé, že většina sterol a brassinosteroid-deficitních mutantů byla izolována při výběru mutant, které měly defekty ve fyziologických procesech (zakrslost, konstitutivní fotomorfogeneze ve tmě) nebo defekty embryogeneze. Teprve po klonování jejich genů se ukázalo, že mají defekt v biosyntéze sterolů nebo brassinosteroidů. Pochopení, jak je vnitrobuněčná koncentrace brassinosteroidů regulována přes syntézu a metabolizmus je důležitou součástí mnoha modelů působení brassinosteroidů (Clouse, 2002).

Regulace

Regulace se může vyskytnout na úrovni transkripce, stability mRNA, translace, enzymové aktivity a dostupnosti substrátu. Může být ovlivňována i vnějšími signály a vývojovými podněty jako je světlo a ostatní hormony. Transkripce CPD genu je specificky regulovaná brassinolidem a citlivost k cykloheximidu naznačuje potřebu de novo (kurzívou???) syntézy regulačního faktoru (Mathur et al., 1998). Množství transkriptů DWF4 je alostericky regulováno vnitrobuněčným obsahem brassinosteroidů. Jeho exprese je velmi nízká v divokém typu huseníčku, ale výrazně stoupá v deficitních mutantech dwf1, bri1 a cpd. To naznačuje, že brassinosteroidové signály jsou potřebné pro snížení exprese DWF4 genu v divokém typu. Reakce katalyzované produkty genu CPD a DWF4 genů pravděpodobně limitují rychlost biosyntézy brassinolidu. Dalším limitujícím krokem je reakce přeměny 6-deoxocastasteronu na castasteron. Ve všech případech je substrát přítomen v buňkách v mnohonásobně větším množství než produkt (Nomura et al., 2001).

Jiný možný mechanizmus regulace je transport brassinosteroidů v rostlinách, který je nejspíš bazipetální, jak je ukázáno ve studiích s brassinosteroidy aplikovanými exogenně (Li a Chory, 1999). Také se spekuluje o tom, ve kterých částech rostliny jsou takto hormony syntetizovány. Například exprese CPD genu byla detekována pouze v kotyledonech rostoucích listů huseníčku. Na druhé straně DET2 je exprimován ve všech orgánech a nezávisle na vývojovém stádiu. Je možné, že exprese může probíhat ve všech orgánech a uplatňují se alosterické regulace závisející na metabolizmu. Brassinosteroidy jsou zřejmě rychleji metabolizovány v listech a pomaleji v kořenech nebo hypokotylech, kde mohou alostericky inhibovat svou biosyntetickou dráhu (Shimada et al., 2003).

Inhibitory biosyntézy

Mutanti s nedostatkem nrassinosteroidů a necitliví k brassinosteroidům jsou dobrým objektem pro studium biologických vlivů brassinosteroidů na rostliny. Informace plynoucí z jejich výzkumu jsou však omezené, protože analýza mutantů byla provedena na relativně malém počtu rostlinných druhů. Proto může být specifický inhibitor biosyntézy brassinosteroidů významným nástrojem pro zkoumání vlivu brassinosteroidů na rostliny v různých stupních vývoje a na buněčné kultury. Inhibitory mohou být použité k doplnění poznatků o mutantech a při vyjasnění a doplnění funkce brassinosteroidů.

KM-01 byl první známý selektivní brassinosteroidový inhibitor, ale pokud byl aplikován samotný, tak nebyl dostatečně aktivní v testech prodlužování hypokotylů ředkvičky (Raphanus sativus) nebo při ohýbání úhlu listu rýže. KM-01 má proto zatím omezené použití(Asami a Yoshida, 1999).

Dalším nalezeným brassinosteroidovým inhibitorem byl brassinazol (v současné době nejznámější a nejpoužívanější). Jeho struktura je podobná struktuře pacrobutrazolu a uniconazolu (inhibitory biosyntézy gibberelinu) a jedním z cílových míst inhibice je 22-hydroxylační krok přeměny 6-oxocampestanolu na cathasteron a nebo oxidační krok přeměny cathasteronu na teasteron. Morfologické změny brassinazolem ošetřených rostlin se podobají změnám u det2 mutantů. Rostliny ošetřené brassinazolem jsou zakrslé s kadeřavými, tmavě zelenými listy, mají změněnou fotomorfogenezi (exprimují větší množství fotosyntetických proteinů) a ve tmě vyvíjí pravé listy. Stupeň vývoje listů a zkrácení hypokotylu jsou závislé na koncentraci brassinazolu. Ošetření brassinazolem ve tmě indukovalo základní kroky vedoucí k diferenciaci plastidů, a toto zjištění předpovědělo další funkci brassinosteroidů v rostlinách. Brassinazol nemá žádný postranní vliv kromě inhibice biosyntézy brassinosteroidů a je vysoce specifický. Limity v použití brassinazolu však jsou. Například při koncentraci 10 ?M nebo větší nemůže být morfologie ošetřených rostlin úplně kompenzována pomocí brassinolidu. Také rostliny větší než huseníček (rajče nebo okurka) potřebují vyšší množství brassinazolu, což může být způsobeno problémy s nasáváním brassinazolu nebo s jeho pohybem v rostlině (Asami et al., 2000; Asami a Yoshida, 1999; Nagata et al., 2000).

Brassinazol 2001 a brassinazol 220, jsou další triazolové inhibitory brassinosteroidové biosyntézy, s podobnými, ale silnějšími a specifičtějšími účinky než má brassinazol. Imazalil (fungicid) by mohl být také jedním z brassinosteroidových inhibitorů, ale imazalilem inhibovaný růst hypokotylu je možno plně obnovit pouze aplikací kombinace 24-epibrassinolidu a gibberelinu a je také pětkrát méně aktivní než brassinazol (Werbrouck et al., 2003).

Degradace brassinosteroidů v rostlinách

Metabolizmus brassinosteroidů byl studován na různých rostlinných druzích a mnoho typů metabolitů bylo již bylo identifikováno jako produkty degradace nebo inaktivace (hydroxylací, oxidací, glykosylací, acylací, nebo degradací postranního řetězce). Nejčastějším produktem po ošetření rajčete (Lycopersicon esculentum) radioaktivním 24-epibrassinolidem byl 25-hydroxy-24-epibrassinolid a 25-?-D-glukosyloxy-24-epibrassinolid (Clouse, 2002). Brassinolid ve fazolových explantátech byl metabolizován na jeho 23-O-?-glukosid. V rýžových explantátech a sazenicích byl exogenně aplikovaný brassinolid metabolizován na neznámé polární ale neglykosidické metabolity. 24-epimery brassinolidu a castasteronu jsou přeměňovány na různé metabolity a jejich konjugáty v suspenzní kultuře buněk rajčete. Mezi metabolity fazolu byl brassinolid bez 26- a 28-metylových skupin, který byl identifikován jako 26-norbrassinolid. Vzniká pomocí brassinolid demetylasy. U mnohých podobných experimentů ani produkty metabolizmu nebyly přesně určeny (Kim et al., 2000b).

Přenos brassinosteroidového signálu

Signální dráhy brassinosteroidů nevyužívají cytoplazmatické steroidové receptory, tak jako je tomu u živočichů a člověka, ale jejich receptor je umístěn v plazmatické membráně, funguje na buněčném povrchu a převádí extracelulární signály do buňky (Li and Chory, 1997). Hlavním brassinosteroidovým receptorem je serin/threonin kinasa BRI1, která je lokalizována v plazmatické membráně a je exprimována ve všech orgánech mladých rostlin huseníčku (Friedrichsen et al., 2000). BRI1 má N-koncovou extracelulární doménu obsahující 25 leucin-rich-repeats (LRR), transmembránovou doménu a cytoplazmatickou serin/threonin kinázovou doménu. BRI1 interaguje s jinou LRR kinasou, BAK1, a tyto dvě se in vitro (kurzívou???) navzájem fosforylují (Wang a He, 2004).

Pozitivními regulátory brassinosteroidového signálu jsou u huseníčku blízce příbuzné proteiny BZR1 a BES1. V přítomnosti brassinosteroidu aktivují BES1 a BZR1 expresi brassinosteroidy-indukovatelných genů. Přídavné složky brassinosteroidové signální dráhy a mediátory brassinosteroidové odpovědi ( zřejmě proteiny jako TRIP-1, BEE1, BEE2, BEE3 a EXO) jsou charakterizovány tím, že koncentrace jejich transkriptů jsou regulovány brassinosteroidy. Např. EXO protein se podílí na přenosu signálů pro růstovou odpověď a jeho nadměrná exprese v divokém typu způsobí zvýšený vegetativní růst. Tento protein upravuje expresi skupiny genů regulovatelných bvrassinosteroidy (KCS1, AGP4, EXP5 a ?-TIP), které se nejspíš účastní růstových procesů (Müssig, 2005). Zvýšená translace proteinu TRIP-1 podpoří růst tabáku a huseníčku. TRIP-1 je podjednotka komplexu eIF3, iniciačního faktoru hrajícího velmi důležitou roli v iniciaci eukaryotní syntézy proteinů. Další cestou, kterou může přenos signálu přímo ovlivnit translaci, může být fosforylace přímo podjednotek eIF3. Je možné, že BRI1 fosforyluje TRIP-1 a tím zvyšuje jeho schopnost sestavovat eIF3 komplex. Bylo zjištěno, že in vitro tato fosforylace probíhá (Jiang a Clouse, 2001).

Navíc k těmto signálním složkám v brassinosteroidové signální dráze funguje také negativní regulátor, cytoplazmatická protein kinasa BIN2. Ta reguluje přenos signálu pomocí přímé fosforylace (a tedy inaktivace) BZR1 a BES1, které jsou pak degradovány v proteosomu. Aktivace BRI1-BAK1 receptorových kinas inhibuje neznámým způsobem BIN2, což umožní akumulaci BZR1 a BES1 a následnou regulaci brassinosteroidových genů (Wang a He, 2004, He et al., 2002). Brassinosteroidová signální dráha dovoluje značnou komunikaci s ostatními signálními drahami a fytohoromony, a také mnoho genů není regulováno výlučně brassinosteroidy. Brassinosteroidy mohou ovlivnit růst rostlin i pomocí genů, které jsou regulovatelné také auxinem nebo regulací biosyntetických a signálních genů jiných rostlinných hormonů (Müssig a Altman, 2003). Několik genů, účastnících se odezvy na gibbereliny je antagonisticky regulováno brassinosteroidy. Brassinosteroidy regulují expresi mnoha genů, které kódují např. xyloglukan endotransglykosylasy a expansiny u soji (Glycine max), rajčete a huseníčku, a prokázalo se, že brassinosteroidy podporují rozvolňování buněčné stěny v epikotylech soji, hypokotylů čínského zelí (Brassica chinensis) a tykve (Cucurbita maxima). U soji se po dvou hodinách po aplikaci brassinosteroidů zvýšilo množství mRNA genu BRU1, který kóduje enzym s xyloglukan specifickou transglykosylační funkcí a s homologií ke xyloglukan endotransglykosylase. Tato regulace na post-transkripční úrovni je specifická pro brassinosteroidy. Gen TCH4 také kóduje xyloglukan endotransglykosylasu podobnou produktu genu BRU1 a je regulovatelný brassinosteroidy, oba tyto geny mají jen jinou místně-časovou specifitu exprese (BRU1 ve vnitřních tkáních, TCH4 ve vyvíjejících se orgánech). Xyloglukan endotransglykosylasy tvoří v huseníčku velkou multi-genovou rodinu, a jen podskupina z nich je regulována brassinosteroidy (Müssig, 2005).

Závislost struktury a aktivity brassinosteroidů

Brassinolid je polyhydroxylovaný derivát 5?-cholestanu, jmenovitě (22R,23R,24S)-2?,3?,22,23-tetrahydroxy-24metyl-B-homo-7-oxa-5?cholestan-6-onu. Základní strukturou je podobný živočišným hormonům odvozených od cholesterolu (androgeny, estrogeny a kortikoidy obratlovců, ekdyson hmyzu a korýšů). Strukturní variace i aktivita závisí na typu a orientaci funkčních skupin na A a B kruzích a postranním řetězci. Odlišnosti v aktivitě mezi různými brassinosteroidy vychází z rozdílů na C-2 a C-3 v A kruhu, přítomnosti laktonu, ketonu nebo oxo-skupiny na C-6 v B kruhu a prostorovém rozložení hydroxylových skupin na postranním řetězci, přítomnosti nebo nepřítomnosti metylové nebo etylové skupiny na C-24. Optimální struktura pro nejvyšší biologickou aktivitu je struktura brassinolidu (laktonová funkční skupina na C-6/C-7, sousedící cis hydroxyly na C-2 a C-3, R konfigurace hydroxylů na C-22/C-23 a metyl jako substituent na C-24) (Clouse, 2002). Jedna z největších překážek používání brassinosteroidů v širokém měřítku na polích je jejich vyšší cena. Izolace brassinosteroidů z přírodních materiálů je kvůli jejich nepatrnému množství v nich obsažených velice pracná a nákladná a pro praktické účely nepřichází v úvahu. Syntetická příprava brassinolidu je také velmi nákladná, proto byla syntetizována řada analogů brassinosteroidů, které mají podobné účinky. Pokrok v chemické syntéze brassinosteroidů a jejich analogů vedl k ekonomicky použitelným postupům, které umožnily jejich praktickou aplikaci v zemědělství. Předpokládá se, že brassinosteroidy se budou stále častěji používat pro zvyšování výnosů. Všechny brassinosteroidy ovšem nejsou biologicky aktivní, nejčastěji se ve fyziologických studiích používá brassinolid, 24-epibrassinolid a 28-homobrassinolid. Pro široké použití v zemědělství je potřeba najít kompromis mezi fyziologickou aktivitou a cenou, proto je vhodné studovat vliv různých brassinosteroidových analogů na růst a vývoj rostlin a to zejména kulturních plodin (Rao et al., 2002).

Na A kruhu má brassinolid sousedící hydroxylové skupiny C-2? a C-3?. Jeho prekurzory jsou brassinosteroidy mající ? hydroxyl, ? hydroxyl nebo keton na pozici C-3, naopak jeho metabolity mohou být brassinosteroidy s 2?, 3?-, 2?, 3?-, nebo 2?, 3?- sousedními hydroxyly. Tyto dvě sousedící hydroxylové skupiny 2? a 3? na A kruhu reprezentují hlavní strukturní rys nejaktivnějších brassinosteroidů jako jsou brassinolid a castasteron. Aktivita klesá směrem 2?, 3? > 2?, 3? > 2?, 3? > 2?, 3?, což naznačuje, že ? orientovaná hydroxylová skupina na C-2 je esenciální pro větší biologickou aktivitu brassinosteroidů v rostlinách.

Co se týče oxidace B kruhu je směr aktivity zhruba 7-oxolakton > 6-keton > 6-deoxo. Výsledky naznačily, že nahrazení 6-keto skupiny ? nebo ? hydroxylovou skupinou vedlo k poklesu aktivity a 6-deoxo analog měl jen velmi malou aktivitu, což potvrzuje, že elektronegativní skupina na C-6 je důležitá pro hormonální účinnost. 6?-fluorinovaný analog měl nízkou aktivitu, podobně jako 6-deoxo analogy. Brassinolid a castasteron jsou C28 brassinosteroidy nesoucí S-metylovou skupinu na C-24 v postranním řetězci. V C28 sériích klesají bioaktivity v tomto pořadí: C-6 lakton > C-6 keton > C-6 ? nebo ? hydroxy > C-6 deoxo. Nahrazení 6-keto skupiny ? hydroxy skupinou vedlo k podobné bioaktivitě při použití vyšších množství (1000 ng), ale k poklesu v nižších množstvích (1, 10 a 100 ng). Nahrazení ? hydroxylem vedlo k poklesu aktivity ve všech dávkách. 6?-fluorinovaný analog vyvolal nízkou aktivitu, podobně jako 6-deoxo analog. 25-fluoro analogy brassinolidu a castasteronu neměly skoro žádnou aktivitu zatímco odpovídající 25-hydroxy analogy měly silnou biologickou aktivitu. 5?-fluoro-28-homocastasteron a 5?-fluoro-28-homotyphasterol měly zvýšenou biologickou aktivitu v porovnání s jejich 5-hydroxy analogy (Ramírez et al., 2005).

Na postranním uhlíkovém řetězci můžeme najít různé substituenty na C-23, C-24 a C-25. Přitom nejaktivnější jsou brassinosteroidy s vazbami metylu nebo etylu na C-24 a metylu na C-25 (Bajguz a Tretyn, 2003). Aktivní sloučeniny mohou mít 24R namísto 22S metylové skupiny, tak jak je tomu u 24-epibrassinolidu. Androstanové analogy castasteronu bez laktonového B kruhu a 22R, 23R diolu také vykazují vysoké biologické aktivity (Kohout et al., 2005).


Vliv brassinosteroidů na rostliny

Brassinosteroidy ovlivňují růstové i reprodukční procesy, stimulují růst i dělení buněk, růst mladých vegetativních pletiv (epikotylu, hypokotylu, koleoptile), indukují kvetení, zrání plodů, klíčení semen, tvorbu a růst kořenů, růst pylových láček, podílejí se na diferenciaci systému vodivých pletiv, hrají spolu s dalšími fytohormony zásadní roli při senescenci, aktivují protonové pumpy v buněčných membránách, ovlivňují fotosyntézu, asimilaci uhlíku a fixaci dusíku, podporují produkci etylenu, chrání rostlinu proti abiotickým i biotickým stresorům a podílejí se i na dalších procesech v rostlině (Müssig, 2005). Vývojové a růstové aktivity jsou hlavně spojeny s ATPázovou aktivitou, syntézou syntetasy 1-aminocyklopropan-1-karboxylové kyseliny změnu v orientaci mikrotubulů, a modifikaci buněčných stěn (Ono et al., 2000)

Vliv brassinosteroidů na růst rostlin a diferenciaci pletiv

Od doby, kdy byl chemicky syntetizován brassinolid a jeho stereoizomer, 24-epibrassinolid (v roce 1981), mohly začít v širokém měřítku pokusy s aplikací brassinosteroidů na různé tkáně a orgány rostlin, a to ve skleníkových i polních podmínkách. První zpráva o vlivech brassinosteroidů na růst huseníčku se objevila v roce 1991, následována krátce nato popisem výběru mutant u této rostliny (které jsou necitlivé k aplikovaným brassinosteroidům nebo jich syntetizují nedostatečné množství) a pozorováním, že brassinosteroidy u tohoto druhu regulují genovou expresi (Rao et al., 2002). Vliv brassinosteroidů na prodlužovací růst byl potvrzen mnoha pracemi. Velmi účinné jsou při stimulaci růstu mladých vegetativních tkání (obsah a tedy i citlivost je v těchto tkáních vyšší). Bylo pozorováno, že brassinosteroidy stimulovaly růst zelené řasy (Chlorella vulgaris) a mycelií Psilocybe cubensis a Gymnopilus purpuratous. Na druhou stranu však inhibovaly růst nádorových buněk vyvolaný Agrobacterium tumefaciens. Aplikace brassinosteroidů tedy většinou růst stimuluje, může ho ale i inhibovat. Studie na epikotylech soji odhalila schopnost brassinosteroidů stimulovat buněčný růst, a ten byl doprovázen výlevem protonů a hyperpolarizací buněčných membrán. V kultuře mrkvových (Daucus carota) buněk vyvolal 24-epibrassinolid pouze zvětšování buněk, aniž by měl jakýkoli vliv na jejich dělení (Rao et al., 2002). Podélný prodlužovací růst buněk je v deficitních mutantech huseníčku (cbb, dwf4, cpd, dim) velmi snížen. Jak lze předpokládat, je u nich nižší i exprese genů spojených s prodlužovacím růstem buněk. Ukázalo se, že brassinosteroidy ovlivňují rekonfiguraci mikrotubulů do příčného uspořádání, které umožňuje podélný růst. Brassinosteroidy mohou podpořit organizaci mikrotubulů a prodlužovací růst buněk přímo, aniž by vzrostla exprese genů tubulinu, nebo mohou ovlivnit transport vody aquaporiny a aktivitu vakuolární protonové (H+) ATPasy, což je oboje spojeno s prodlužovacím růstem buněk (Clouse, 2002, Morillon et al., 2000). Brassinosteroidy ovlivňují zřejmě stejnou měrou růst i dělení buněk. Ovlivňují také kinetiku buněčného cyklu v synchronizovaných kulturách buněk tabáku (Nicotiana tabacum) a také regulují geny exprimující se v S fázi, včetně histonu H2B a HMG1 proteinu (high mobility group). Stimulující role brassinosteroidů na dělení buněk byla ověřena tím, že ošetření kultury buněk deficitního det2 mutanta 24-epibrassinolidem zvýšilo množství transkripce genu kódujícího cyklin D3, protein potřebný pro regulaci přechodu G1 a S fáze v buněčném cyklu. 24-epibrassinolid může také účinně nahradit zeatin při růstu kalusu huseníčku a v buněčné suspenzní kultuře (Clouse, 2002). Regulace syntézy a aktivity enzymů účastnících se modifikace buněčné stěny (jako jsou xyloglukan endotransglykosylasy, glukanasy, expansiny a další) se stala častým místem působení hormonů regulujících prodlužovací růst buněk. Nanomolární koncentrace brassinolidu stimuluje tvoření tracheid (xylogenezi) v izolovaných mezofylových buňkách ostálky (Zinnia elegans). U ní také brassinosteroidy regulují expresi několika genů spojených s utvářením xylému. U huseníčku dokázala mikroskopická analýza mutantů roli brassinosteroidů při cévní diferenciaci. V brassinosteroidovém deficitním cpd mutantovi se asymetricky dělí kambium (produkuje nadpočet floémových buněk na úkor buněk xylému). Brassinosteroidy jsou v rostlině mobilní, brassinolid aplikovaný na kořeny mladých intaktních rajčat a ředkviček působil na hypokotyly a epikotyly nebo ošetření bází hypokotylů vigny (Vigna radiata) způsobuje prodloužení epikotylů (Rao et al., 2002). Brassinosteroidy regulují expresi mnoha genů, přispívajích k regulaci buněčného dělení a diferenciace, a pomáhají řídit celkové vývojové procesy vedoucí k morfogenezi rostliny. Podílejí se na regulaci fotomorfogeneze, skotomorfogeneze a buněčného růstu v přítomnosti buněčné stěny, která je potenciálním limitem růstu (Clouse, 2002).

Vliv brassinosteroidů na kořeny

Kim et al., (2000b) zjistili přítomnost castasteronu v primárních kořenech kukuřice. Detekované množství castasteronu bylo výrazně nižší než ve výhoncích. Yokota et al., (2001) dokázali přítomnost mnoha druhů brassinosteroidů v kořenech rajčete. Koncentrace 28-norcastasteronu a castasteronu jsou ve výhoncích vysoké, ale v kořenech velmi nízké, což naznačuje, že v kořenech je potřeba mnohem nižší množství brassinosteroidů než ve výhoncích a jiných částech rostliny. Vzhledem k tomu, že byly v kořenech nalezeny brassinosteroidy, jsou v kořenech také syntetizovány proteiny potřebné pro biosyntézu brassinosteroidů (DIM, DET2 a některé fytochromy P450), stejně tak jako proteiny potřebné pro přenos brassinosteroidového signálu (BRI1 a BAK1). To naznačuje, že brassinosteroidy jsou důležité regulační sloučeniny také pro růst a vývoj kořenů. Pokusy, při kterých bylo studováno ovlivnění růstu kořenů brassinosteroidy, prokázaly inhibiční i stimulační účinky na růst kořenů. Bohužel se při těchto pokusech pracovalo jen s kořenovými segmenty a byly tak přerušeny mnohé signalizační dráhy. 24-epibrassinolid měl inhibiční vliv na formaci kořenů u sazenic fazolu, pšenice (Triticum aestivum) a kukuřice (Zea mays) (Müssig, 2005). Guan a Roddick (1988) zjistili inhibiční vliv 0,1 ?M 24-epibrassinolidu na růst kořenů rajčete, také stejná koncentrace 24-epibrassinolidu silně inhibovala růst kořenů huseníčku. Ale inhibiční vliv brassinosteroidů na růst kořenů odporuje faktu, že mutanti mají redukovaný kořenový systém. Müssig et al., (2003) zjistili, že velmi malé koncentrace 24-epibrassinolidu (0,005 nM - 0,1 nM) podporují růst kořenů huseníčku, zatímco při vyšších koncentracích (>1 nM) byl růst kořenů inhibován. V deficitních mutantech (zde byl použit cbb3) je na vyvolání inhibice růstu potřeba vyšší množství brassinosteroidů (>10 nM), nižší koncentrace růst kořenů stimulují. Lze říct, že nízké koncentrace brassinosteroidů podporují růst kořenů a brassinosteroidy přejdou na cestu inhibice pokud je překročena hraniční koncentrace brassinosteroidů. Tato hraniční koncentrace je nižší u 24-epibrassinolidu než u 24-epicastasteronu, a vyšší v mutantech necitlivých k brassinosteroidům. Tato hranice závisí na biologické aktivitě aplikovaného brassinosteroidu a genotypu rostliny (Müssig, 2005).

Fujii a Saka (2001) prokázali, že ponoření obilek rýže do roztoku brassinolidu (2x10-7 M, 2x10-8 M, 2x10-9 M) na 4 dny zvýšilo délku výhonku v každé z pozorovaných koncentrací, ale ovlivňovalo negativně délku hlavního kořene v závislosti na koncentraci (víc při vyšší koncentraci), ošetření pouze prvních 24 hodin pozitivně ovlivnilo délku výhonku i kořene a ošetření pouze čtvrtý den nemělo prokazatelný vliv. Z toho vyplývá, že doba ošetření, koncentrace a vývojové stádium rostliny má i zde velký vliv na působení brassinosteroidů na rostlinu.

Exogenně aplikovaný brassinolid (10-9 M a 10-5 M) zvýšil gravitropické zakřivení v primárních kořenech kukuřice. Takto vyvolané zakřivení bylo velmi zvýrazněno přítomností auxinu (10-8 M a 10-10 M), což ukazuje, že brassinolid spolupracuje s auxinem při gravitropickém zakřivení primárních kořenů kukuřice. Aktivace gravitropického zakřivení pomocí brassinolidu byla plně anulována při aplikaci inhibitoru polárního transportu auxinu (Kim et al., 2000a).

Vliv brassinosteroidů na květy a semena

Brasisinosteroidy pravděpodobně podporují růst pylové láčky při prorůstání do bliznou (Müssig, 2005).Obsah brassinosteroidů v pylu je oproti jiným částem rostliny velmi vysoký, což naznačuje, že brassinosteroidy mohou mít významnou roli při regulaci reprodukce. Velmi vysoké koncentrace brassinosteroidů byly nalezeny také v semenech (Bajguz a Tretyn, 2003). Aplikace brassinolidu zlepšila klíčení řeřichy (Lepidium sativum). Podobně ošetření semen eukalyptu (Eucalyptus camaldulensis) 24-epibrassinolidem významně zvýšilo procento klíčících semen. Brassinolid, 24-epibrassinolid a 28-homobrassinolid podpořily klíčení semen podzemnice olejné (Arachis hypogaea). Obdobné výsledky byly získány při ošetření semen řepky, rajčete, tabáku, a dalších (Rao et al., 2002). Snížená fertilita nebo samčí sterilita jsou běžné charakteristiky mutantů s nedostatkem brassinosteroidů nebo necitlivých k brassinosteroidům. Například samčí sterilita pozorovaná u cpd mutanta závisela na neschopnosti pylu prodlužovat se během klíčení. Ale u dwf4 mutanta se pyl zdá být životaschopný a sterilitu způsobuje kratší délka nitky prašníku, což způsobí, že pyl je uložen častěji na stěně semeníku, než na povrchu blizny (Clouse, 2002). Ukázalo se, že v zásadě brassinosteroidy zlepšují klíčení semen a růst sazenic. Tento vliv může zvýšit výnos, zejména v suboptimálních růstových podmínkách (Khripach et al., 2000).

Vliv brassinosteroidů na výnos

Ihned po objevení brassinosteroidů byly iniciovány studie možnosti využití brassinosteroidů na zlepšení výnosu zemědělských plodin, a to jak v laboratorních, tak v polních podmínkách. Brassinosteroidy zvýšily výnos pšenice, ječmene, rýže, kukuřice, soji, fazolu, podzemnice olejné, hlávkového salátu, ředkviček, rajčat, mrkve, celeru, cibule, česneku, brambor, špenátu, papriky, bavlníku, čajovníku, kávovníku, jabloní, jahod, citrusů, vodního melounu, cukrové řepy, hořčice, řepky, tabáku, okurky, hroznů, a dalších (Hayat et al., 2000, Rao et al., 2002, Peng et al., 2003, Müssig, 2005).

Brassinosteroidy zcela prokazatelně zvyšují výnos mnoha kulturních plodin, zvlášť v suboptimálních podmínkách, jsou pro rostliny zcela přirozené a neškodí životnímu prostředí. Jsou tedy vhodné k široké aplikaci v zemědělství pro zvýšení výnosů a ochranu rostlin (Khripach et al., 2000).

Vliv brassinosteroidů na stárnutí

Stárnutí rostlin je regulováno fytohormony a i zde hrají brassinosteroidy důležitou roli. Brassinolid zrychlil stárnutí v explantátech řepeně (Xanthium) a šťovíku (Rumex). Byla popsána schopnost brassinosteroidů vyvolat stárnutí v izolovaných dělohách okurkových sazenic a listů sazenic fazolu. Brassinosteroidové deficitní mutanti huseníčku vykazovali zpoždění ve stárnutí chloroplastů. Brassinolid zpožďuje odpadnutí listů citrusu (Rao et al., 2002).

Mnoho brassinosteroidových mutantů má prodlouženou délku života a zpožděnou senescenci. Zpožděné stárnutí koreluje se sníženou fertilitou, sterilní mutanti jako je bri1 (brassinosteroidový insenzitivní) mají nejvíc zpožděný vývoj. Předpokládá se, že neschopnost vytvářet signály pro nástup senescence v neplodných mutantech vede k pozorovanému prodloužení délky života rostliny. Toto tvrzení také podpořilo domněnku o roli brassinosteroidů při navozování stárnutí u rostlin (Clouse, 2002).

Vliv brassinosteroidů na ostatní procesy v rostlinách

Postřik brassinolidem může hrát důležitou roli ve zvyšování komerční hodnoty ovoce litchi (Litchi chinensis). Obsah Ca2+ v perikarpu tohoto ovoce stoupl díky postřiku brassinolidem (v koncentracích 0,5 mg/l, 0,75 mg/l a 1 mg/l), hlavně při aplikaci během časných stádií vývoje plodů. Vyšší nárůst byl pozorován při vyšší použité koncentraci. Obsah pektinu v perikarpu ošetřených plodů byl vyšší v časnějších stádiích vývoje než v pozdějších, zatímco zůstal relativně konstantní u kontroly. Během časných stádií vývoje plodů, byly po postřiku brassinolidem zvýšené obsahy pectin metylesterasy a polygalacturonasy. Toto zvýšení bylo závislé na použité koncentraci. Aktivita celulasy byla silně inhibována u ošetřených rostlin v porovnání s kontrolou. Ošetření brassinoslidem také podpořilo růst, produkci plodů a zmírnilo jejich praskání. Postřik na listy tedy výrazně ovlivnil enzymové aktivity, obsah vápníku v perikarpu plodů a snížil praskání plodů. (Peng et al., 2003).

Rostliny hořčice (Brassica juncea) byly postříkány vodným roztokem 28-homobrassinolidu (v koncentracích 10-10 M, 10-8 M a 10-6 M) 30 dnů po zasetí. Po dalších 30ti dnech byla změřena čerstvá a suchá hmotnost rostlin, koncentrace dusíku, fosforu a draslíku, aktivta karbonátdehydratasy a čistá rychlost fotosyntézy v listech. Výnosové charakteristiky byly zjišťovány po dozrání lusků. Rostliny ošetřené 28-homobrassinolidem měly výrazně vyšší čerstvou a suchou hmotnost listů a měly účinnější fotosyntézu a vyšší aktivitu karbonátdehydratasy v porovnání s kontrolou. Maximální odpověď byla vyvolána koncentrací 10-8 M 28-homobrassinolidu. Ošetřené rostliny také produkovaly víc lusků a semen. V koncentracích dusíku, fosfotu a draslíku nebyly zjištěny žádné významné rozdíly. Koncentarce 10-6 M měla vliv porovnatelný s koncentrací 10-8 M. (Hayat et al., 2000). Bylo zjištěno, že aplikace brassinosteroidů zvýšila nodulaci a fixaci dusíku v podzemnici olejné (Rao et al., 2002).

Ukázalo se, že 24-epibrassinolid přímo ovlivnil rychlost fotosyntézy v listech okurky. Po ošetření 24-epibrassinolidem (0,01 mg/l, 0,1 mg/l a 1 mg/l) byla výrazně zvýšena rychlost asimilace CO2 (nejvíc při ošetření 0,1 mg/l), což bylo spojeno s vyšší rychlostí karboxylace pomocí Rubisco. Aplikace 24-epibrassinolidu také zvýšila kvantový výtěžek přenosu elektronů přes fotosystém II. Tyto vlivy byly nejvýrazněji patrné 3 hodiny po listovém postřiku (Yu et al., 2004).

Brassinosteroidy stimulují růst hypokotylů huseníčku na světle, ale inhibují jeho růst za tmy. Nicméně přiměřené koncentrace brassinosteroidů jsou potřebné jak pro růst na světle, tak i ve tmě (mutanti jsou také zakrslí ve tmě i na světle a brassinazol inhibuje růst také i ve tmě i na světle). Bylo zjištěno, že několik de-etiolovaných mutantů izolovaných při výběru rostlin rostoucích ve tmě tak, jako by rostly na světle, má mutace v genech kódujících enzymy biosyntetické dráhy brassinosteroidů. Neff et al., (1999) předpokládá, že metabolizmus brassinosteroidů má souvislost s fytochromovou signalizací, Kang et al., (2001) dokázal, že tmou indukovatelný a světlem potlačitelný malý G protein Pra2 aktivuje cytochrom P450 C-2 hydroxylasu, která je součástí biosyntézy brassinolidu. Světlo je tedy jedním z regulátorů brassinosteroidové odpovědi. Je možné, že existuje optimální koncentrace brassinosteroidů v sazenicích. Nad tuto prahovou koncentraci, (která může záviset na vnějších podmínkách) brassinosteroidy růst inhibují. Interakce s ostatními fytohormony také může určit stupeň brassinosteroidové odpovědi. (Müssig, 2005).

Brassinosteroidy ovlivňují mnoho procesů v rostlině. To, zda toto ovlivnění bude pozitivní nebo negativní velmi záleží na době aplikace brassinosteroidů, koncentraci, stáří a celkové kondici rostliny a na typu aplikovaného brassinosteroidu. Tyto procesy jsou ovlivněny hlavně přenosem signálu a expresí brassinosteroidy-indukovatelných genů. Přitom nelze zapomínat na interakce s ostatními fytohormony a vliv prostředí.

Protistresové účinky

Rostliny nemají motorický aparát, proto nemohou utéct před stresy z okolí. Brassinosteroidy zvyšují odolnost rostlin vůči různým abiotickým i biotickým stresům. Zvyšují odolnost rostlin k vysokým a nízkým teplotám, k vodnímu deficitu nebo zamokření substrátu, nadměrným koncentracím těžkých kovů nebo solí, pesticidům a herbicidům (abiotické stresy) a působení bakterií, virů či hub (biotické stresy). O mechanizmech těchto účinků je zatím známo pouze málo. Mechanizmem, který se může podílet na odolnosti k různým typům stresu je například zvýšená aktivita antioxidantů a jejich vysoký obsah při odpovědi na vysoké a nízké teploty, zasolení, sucho a zraňování a na oxidativní stres, a může hrát hlavní roli při získávání odolnosti rostlin na různé stresy z okolí (Mazorra et al., 2002). Byla také zjištěna vyšší exprese heat shock proteinů nebo ATP (Dhaubhadel et al., 2002, Rao et al., 2002)

Nízká teplota

Teplotní změny se v přírodě vyskytují častěji než ostatní druhy stresových faktorů a mnoho fyziologických procesů v rostlině je ovlivněno nízkou teplotou (fotosyntéza, klíčivost, zakořeňování, nasazování květů nebo plodů). Mnoho ekonomicky významných plodin pochází z tropických a subtropických krajin a pro růst potřebují relativně vysoké teploty, takže jsou tyto plodiny v chladnějších zeměpisných šířkách často vystaveny chladovému stresu. Chladová tolerance může být indukována růstovými regulátory. Indukovaná tolerance je ale doprovázená zpožděním růstu po ošetření. Postřik regulátory (jako je triadimefon a metyljasmonát) před ochlazením zvýší endogenní obsah kyseliny abscisové a sníží tak poškození chladem. Podobně také aplikace kyseliny abscisové před stresem chladem sníží poškození mnoha citlivých rostlin. Chladová tolerance je však v mnoha pokusech vyvolaná kyselinou abscisovou v relativně vysoké koncentraci, což inhibuje růst rostlin a buněk (Yu et al., 2002). Yu et al., (2002) zkoumali vliv 24-epibrassinolidu a kyseliny abscisové na sazenice okurky při 2, 4 a 8?C. Okurka byla použita jako pokusný materiál, protože je citlivá k chladu. Sazenice byly pěstovány při optimálních růstových podmínkách (30/20?C) a ve stádiu tří listů byly ošetřeny 24-epibrassinolidem (v koncentracích 0,1 mg/l a 1 mg/l). Den nato byly sazenice na 2-3 dny ochlazeny, a pak vráceny do tepla na dalších 14 dnů. Studium se zaměřilo na zmírnění chladem vyvolané inhibice fotosyntézy. Chladový stres způsobil viditelná poškození listů (skvrny na listech, které byly spočítány a použity na výpočet indexu poškození listů chladem). Byla měřena fluorescence po 15ti minutách zatemění, maximální účinnost fotosystému II a čistá rychlost fotosyntézy. Fotosyntetické procesy jsou často jako první inhibovány chladnou teplotou. Fotoinhibice (naznačená poklesem maximální účinnosti fotosyntézy) se vyskytla při 4 a 2?C, ale ne při 8?C. Předošetření kyselinou abscisovou a 24-epibrassinolidem výrazně zmírnilo poškození chladem, index poškození byl nižší než u kontroly. Fotochemická účinnost nebyla ovlivněna po vystavení 8?C, nepříznivý vliv při 4?C byl pouze mírný, ale účinnost se výrazně snížila po 2-3 dnech ve 2 ?C. 24-epibrassinolid výrazně zvýšil účinnost fotosyntézy u rostlin ve 2 a 4 ?C. Čistá rychlost fotosyntézy a zdánlivý výtěžek fotosyntézy u neošetřených sazenic chlazených při 4 ?C klesl na 40% a 39% oproti nechlazeným rost



Nový příspěvek


Ochrana proti spamu. Kolik je 2x4?



Na-mobil.cz

Spřátelené weby

Přidat stránku k oblíbeným

Nejnovější v diskusi

Diskusní fórum »

TIP: Chcete zkrátit dlouho chvíli sobě nebo blízkému?
Klikněte na Puzzle-prodej.cz a vyberte si z 5000 motivů skladem!
TIP: Hračky a hry za dobré ceny?
Klikněte na Hračky obchod.cz a vyberte si z tisícovky hraček skladem!